科研 |深圳技术&西南民族：蛋白质组学揭示传统草药余甘子抗肝纤维化的多靶点机制（国人佳作）

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编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

余甘子（PE）是一种传统的多民族草药，常用于治疗肝病。我们之前的研究表明，PE水提取物（AEPE）可以减轻四氯化碳（CCl4）诱导的体内肝纤维化，但其潜在的分子机制尚不清楚。本研究旨在通过蛋白质组学线索阐明PE治疗肝纤维化的多靶点机制。我们建立了CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型；通过血清生化指标和病理染色评价AEPE化学组分的抗肝纤维化作用。此外，基于串联质谱标签（TMT）的定量蛋白质组学技术被用于检测肝脏差异表达蛋白（DEPs）。我们利用《京都基因与基因组百科全书》（KEGG）通路富集、基因本体（GO）富集和蛋白质相互作用（PPI）网络对DEPs进行生物信息学分析。免疫印迹分析用于验证AEPE有效成分调节的关键潜在靶点。AEPE低分子量组分（LWPE）被确定为最佳的抗肝纤维化活性组分，可显著提高模型大鼠ALT、AST、HA、Col IV、PCIII、LN、Hyp水平，减轻肝组织病理性纤维化病变。LWPE干预后，我们共筛选到了195个DEPs。GO分析表明，DEPs主要与细胞外基质组织、肌动蛋白结合和细胞外泌体有关。KEGG通路分析表明，DEPs主要与ECM受体相互作用、局部粘附和PI3K-Akt信号通路有关。结合GO、KEGG和免疫印迹结果，COL1A2、ITGAV、TLR2、ACE和PDGFRB可能是PE治疗肝纤维化的潜在靶点。综上所述，LWPE通过多途径、多靶点调节发挥治疗作用。这项研究可能为PE治疗肝纤维化的研究提供蛋白质组学线索。

论文ID

原名：Tandem mass tag-based proteomics analysis reveals the multitarget mechanisms of Phyllanthus emblica against liver fibrosis译名：基于串联质谱标签的蛋白质组学分析揭示了余甘子抗肝纤维化的多靶点机制期刊：Frontiers in PharmacologyIF：5.988发表时间：2022.10通讯作者：吴炎 & 顾健通讯作者单位：深圳技术大学和西南民族大学

实验设计

实验结果

1. 植物化学的研究
我们通过HPLC对LWPE中的没食子酸和没食子酸甲酯进行鉴定和定量，没食子酸在7.207 min的保留时间和没食子酸甲酯在23.297 min的保留时间出现色谱峰（图2）。我们使用没食子酸（y=11921+828.68，r2=0.9995）和没食子酸甲酯（y=12752+36.651，r2=0.9999）的六点回归曲线进行量化。LWPE中没食子酸和没食子酸甲酯的含量分别为14.06和3.71mg/ml。图1 蛋白质组学实验设计概览
2. PE水提物及其组分对四氯化碳所致大鼠肝损伤的影响
通过H&E染色和血清生化分析，我们探讨AEPE及其组分对四氯化碳肝损伤的保护作用。如图3A所示，对照组的肝组织呈现自然的小叶结构和细胞结构，未观察到明显的病理变化。相比之下，模型组出现严重的肝细胞肿胀和坏死、淋巴细胞浸润、脂肪变性和纤维间隔。在AEPE、LWPE和水飞蓟素组中，异常组织学改变明显减少。同时，与CCl4对照组相比，AEPE、LWPE和水飞蓟素处理的大鼠肝纤维化的平均严重程度评分显著降低（p<0.05）（图3B）。然而，HWPE对肝脏组织学改变无明显影响。表1 AEPE及其组分对CCl₄诱导的大鼠肝纤维化中LN、HA、IV-C和PCIII含量的影响数据表示为平均值±SEM（n=7–10）。##与对照组比较p<0.01；*与模型组相比，p<0.05，**p<0.01。
此外，经CCl₄处理后，大鼠肝脏充血并增大。如图3C所示，AEPE和LWPE处理后，模型大鼠肝脏指数增加的幅度减小（p<0.01）。血清生化标志物的测量结果如图3D和图3E所示。模型组血清ALT和AST水平显著高于对照组（p<0.01），但经AEPE、LWPE或水飞蓟素处理后下降（p<0.01）。然而，与模型大鼠相比，HWPE组的ALT水平没有明显变化。图2 LWPE (A)、没食子酸(B)和没食子酸甲酯(C)的高效液相色谱图
3. PE水提物及其组分对四氯化碳致大鼠肝纤维化的影响
胶原蛋白是ECM的主要成分之一，导致肝纤维化的发展。因此，我们通过Masson三色染色检查肝组织中的胶原沉积。如图4A所示，模型组的多个门静脉区域有明显的胶原堆积，并观察到假小叶形成。经AEPE、LWPE或水飞蓟素处理后，胶原沉积减少。与对照组相比，模型组肝切片的纤维化面积显著增加，但除HWPE组外，其他试验药物组均有所下降（p<0.01，图4B）。作为胶原纤维中的一种独特氨基酸，模型组肝组织中Hyp含量显著高于对照组，但在AEPE、LWPE、HWPE和水飞蓟素组中有所下降（p<0.05，图4C）。图3 AEPE及其组分对CCl₄给药大鼠肝损伤的影响(A)每组用H&E染色的代表性肝组织病理切片(放大，×200)。（B）H&E染色肝纤维化严重程度评分。（C）计算各组大鼠的肝脏与体重比。（D）血清中的ALT水平。（E）血清中AST水平。Control，对照组。Model，模型组。AEPE，PE组水提物。LWPE，PE组分的低分子量组分。HWPE，PE的高分子量组分。Silymarin，水飞蓟素组。数据表示为平均值±SEM（n=7–10）。##与对照组比较p<0.01；*与模型组相比，p<0.05，**p<0.01。
同时，我们用ELISA法进一步检测包括LN、HA、IV-C和PCIII在内的血清纤维化生物标志物，结果如表1所示。CCl₄处理后，大鼠血清中这些指标的水平显著升高（p<0.01）。与模型组相比，AEPE和LWPE处理后血清LN、NA、PCIII和IV-C水平显著降低（p<0.05）。然而，模型大鼠和HWPE组之间的四项指标没有显著差异（p>0.05）。这些结果表明，抗肝纤维化活性成分主要存在于PE水提取物的低分子量部分，即LWPE部分。因此，我们选择LWPE组进行深入的蛋白质组分析，以阐明PE抗肝纤维化的多靶点机制。图4 AEPE及其组分对CCl₄大鼠肝纤维化的影响（A）用Masson染色的代表性大鼠肝脏切片（放大倍率×200）。（B）Masson染色阳性区域。（C）肝组织中的Hyp含量。数据表示为平均值±SEM（n=7–10）。##与对照组比较p<0.01；*与模型组相比，p<0.05，**p<0.01。
4. 基于串联质谱标签的肝组织蛋白质组学分析
TMT定量蛋白质组学共检测到65457个独特肽和7550个蛋白质。在这些蛋白质中，7525个被量化（图5A）。蛋白质的相对变化如图5B-D所示。根据1.2倍变化的临界值，在模型/对照组中，1172个蛋白质上调，1310个蛋白质下调（补充表S1）。在LWPE/模型组中，我们发现281个DEPs（74个上调，207个下调）。重要的是，模型/对照组中165个上调的DEPs在LWPE/模型组中下调，模型/对照组中30个下调的DEPs在LWPE/模型组中上调（图5E）。图5F；补充表S2列出了由LWPE处理反向调节的195个DEPs的详细信息。图5 对照组、模型组和LWPE处理组大鼠肝脏中差异表达蛋白（DEPs）的鉴定（A）样品MS结果的基本统计。（B）不同比较组中的DEPs数。（C和D）不同比较组中DEPs的火山图。红点表示上调蛋白，蓝点表示下调蛋白，根据倍数变化（FC）>1.2或<1/1.2以及校正的p值<0.05筛选。（E）显示重叠蛋白质分布的维恩图。（F）195个DEPs的层次聚类分析。颜色表示蛋白质的倍数变化，深蓝色表示减少，而红色表示增加。
5. 差异表达蛋白的生物信息学分析
5.1 差异表达蛋白的亚细胞定位和结构域分析DEPs的亚细胞定位分析有助于进一步了解DEPs蛋白在细胞中的功能。我们应用CELLO软件显示每个亚细胞器中DEPs的数量和分布比例（图6A）。DEPs主要位于细胞核（33.20%）、细胞质（28.69%）、细胞外（17.62%）和质膜（13.11%）。结构域预测软件InterProScan用于预测DEPs的结构域，结构域（前20个）中的蛋白质数量如图6B所示。含有胶原蛋白三螺旋重复序列（20个拷贝）、富含亮氨酸重复序列、免疫球蛋白I-set结构域、富含亮氨酸重复N末端结构域和免疫球蛋白结构域的DEPs数量最多。图6 基于亚细胞定位和结构域的DEPs分类（A）DEPs在每个亚细胞器中的数量和分布比例。（B）结构域中的蛋白质数量（前20个）。
5.2 差异表达蛋白的功能分类为了全面了解DEPs在生物体内的功能、定位和生物途径，我们通过GO分析对DEPs进行了注释。设置p值（p）<0.05，错误发现率（FDR）<0.05，共获得52项，其中BP有10项，MF有12项，CC占30项，图7A显示了GO分析的概述，我们分别选择了BP、CC和MF类别中最丰富的前10个术语。对于GO富集分析，气泡图中给出了BP、MF和最显著富集的前20个CC项的结果。在生物学过程中（图7B），DEPs主要参与细胞外基质组织和细胞粘附。在分子功能方面，肌动蛋白结合、细胞外基质结构成分、血小板衍生生长因子结合和蛋白质结合受到显著调节（图7C）。在细胞成分类别中，结果表明DEPs与细胞外外泌体、细胞外基质和局部粘附显著相关（图7D）。图7 生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）的GO注释分类分析（A）BP、CC和MF类别中最丰富的前10个术语。（B）BP中DEPs的富集气泡图。（C）前20个CC中DEP的富集气泡图。（D）MF中DEPs的富集气泡图。p<0.05，FDR<0.05。
5.3 差异表达蛋白的京都基因与基因组百科全书分析我们使用KEGG分析DEPs的通路富集，共富集了15条通路（p<0.05，补充表S3）。KEGG通路富集气泡图分析显示，这些DEPs在ECM受体相互作用、局部粘附和PI3K-Akt信号途径中富集（图8A）。为了进一步探索富集的通路类型，如图8B所示，我们对15条通路进行了分类，其中大多数DEPs富集于人类疾病相关途径，提示LWPE抗纤维化作用的机制是多功能的，涉及多种途径。
5.4 差异表达蛋白的蛋白-蛋白相互作用分析STRING在线数据库用于确定DEPs之间的关系，以阐明串扰的分子机制，蛋白质相互作用参数评分值为“中等置信度>0.4”。共有172个节点和456条边相互连接（图8C）。我们通过Cytoscape软件进一步构建PPI网络，以分析和可视化靶标蛋白的重要性，结果表明，ITGB1、COL1A2、ITGAV、TLR2、ACE和PDGFRB占据PPI网络的中心，并充当与其他差异表达蛋白相互作用的枢纽（图8D）。图8 DEPs的《京都基因与基因组百科全书》（KEGG）通路分析和蛋白质相互作用（PPI）网络分析（A）KEGG途径的分类。（B）KEGG途径中DEPs的富集气泡图，p<0.05。（C）STRING数据库DEP之间的PPI分析，中等置信度>0.4。（D）DEPs的Cytoscape分析。
6. 免疫印迹分析
我们通过Western blot检测肝组织中COL1A2、ITGAV、TLR2、ACE和PDGFRB的蛋白表达水平，以进一步验证定量蛋白质组学分析的结果。如图9所示，与对照组相比，模型组COL1A2、ITGAV、TLR2、ACE和PDGFRB的表达水平均显著增加（p<0.01）。与模型组相比，LWPE显著下调了这些蛋白的水平（p<0.01）。结果与基于TMT的蛋白质组分析中的蛋白质谱一致。图9 关键蛋白质的蛋白质印迹分析（A）GAPDH、COL1A2、ITGAV、TLR2、ACE和PDGFRB的蛋白表达水平；（B）模型组与LWPE组的蛋白质相对水平。数据表示为平均值±SEM（n=3）。##与对照组比较p<0.01；*与模型组相比，p<0.05，**p<0.01。

讨论

在本研究中，我们使用CCl₄诱导的大鼠模型评估AEPE及其组分的抗肝纤维化作用。综合血清生化分析和组织病理学检查证明，LWPE主要含有次生代谢产物，是AEPE的最佳有效化学成分。我们之前的工作表明，LWPE含有多种酚酸和类黄酮，如没食子酸、柯里拉京、鞣花酸等。据报道，这些单体成分通过干扰不同的分子信号通路，对肝纤维化具有抑制作用。因此，LWPE具有多成分、多靶点综合治疗肝纤维化的特点，这使得很难阐明LWPE的作用机制。

目前，高通量蛋白质组技术已广泛应用于寻找肝脏疾病的生物标志物和药物靶点，为确定LWPE治疗肝纤维化的多靶点机制提供了合适的技术工具。我们使用基于TMT的定量蛋白质组学在肝组织中鉴定了195个由LWPE调节的DEPs。通过GO富集分析，DEPs与ECM组织、ECM结构成分和胞外泌体高度相关。在肝纤维化形成过程中，HSCs在各种生物因子的刺激下被激活，然后转化为肌成纤维细胞，导致ECM过度沉积，这是肝纤维化的常见病理特征。ECM由糖蛋白和蛋白聚糖（PGs）的异质混合物组成，包括LN、纤维连接蛋白、胶原蛋白、HA和硫酸乙酰肝素PGs。在我们的实验药效学结果中，与模型组相比，LWPE组的HA、LN、IV-C、PCIII和Hyp含量显著降低。因此，LWPE可能通过减少ECM的合成和积累来减轻CCl₄诱导的肝纤维化。

KEGG途径富集表明DEPs与ECM受体相互作用、局部粘附和PI3K-Akt信号通路有关。有趣的是，ECM受体相互作用和PI3K-Akt信号通路参与了局部粘附。研究证明，局灶性粘连在HSC活化中起着重要作用，活化的HSCs中局灶性粘附的分解可能有助于逆转肝纤维化。此外，ECM主要分布和聚集在细胞表面和细胞间物质上，细胞与ECM的粘附由ECM受体即整合素、盘状结构域和多配体蛋白聚糖syndecans介导。整合素激活黏着斑激酶（FAK）和Src家族激酶，随后刺激下游信号级联，如PI3K/Akt信号通路。激活PI3K/Akt通路可诱导不同类型细胞中ECM的表达。抑制HSCs中PI3K信号传导减少胶原合成和ECM沉积，并降低促纤维化因子的表达。研究表明，PE提取物可以抑制Akt过度活化，从而抑制PI3K/Akt的失调。我们推测LWPE可以通过调节多种途径减轻肝纤维化，包括ECM受体相互作用、局部粘附和PI3K-Akt信号通路。

此外，根据PPI网络分析，COL1A2、ITGAV、TLR2、ACE和PDGFRB位于网络的中心，呈现在多个富集的信号通路中。因此，我们选择这些具有代表性的蛋白质进行进一步的分子生物技术验证，结果证明LWPE可以降低CCl₄引起的上述蛋白质表达。

胶原是纤维化发生时最丰富的ECM蛋白，约占肝硬化干肝重量的50%。在已知的28种胶原蛋白中，至少有11种在肝组织中表达。在本研究中，定量蛋白质分析表明，LWPE处理后，模型大鼠肝组织中的各种胶原蛋白（包括Col5a1、Col3a1、Col1a2、Col6a1和Col6a2）减少。迄今为止，研究者们在纤维化过程中没有发现最重要的ECM蛋白，I型和III型胶原蛋白是最丰富的胶原蛋白，其次是IV型、V型和VI型胶原蛋白。在这些胶原蛋白中，I型胶原蛋白亚基分子是一种由两条α1链和一条α2链组成的形成纤维的异源三聚体蛋白，它们折叠成高度有序和稳定的三股螺旋。Col1a1通过抑制I型胶原的合成，是治疗肝纤维化的有效靶点，这已在许多研究中得到证实。据我们所知，Col1a2在肝纤维化中的作用仍知之甚少。我们通过免疫印迹证实LWPE可以降低Col1a2的表达，这表明Col1a1可能是治疗肝纤维化的潜在有效靶点。

Toll样受体（TLR）是一类模式识别受体，在炎症反应和肝纤维化的调节中发挥着特殊作用。TLR2是最常见的TLR之一，广泛表达于介导肝病发病机制的实质性和非实质性肝细胞，包括酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎。TLR2信号通路诱导NF-κB移位到细胞核，并最终调节基因转录以及炎性细胞因子的产生，这些被认为是参与肝纤维化病理过程的主要肝毒性介质。据报道，TLR2基因敲除能够通过下调促纤维化和促炎症基因的表达，减轻CCl₄诱导的小鼠肝纤维化。以前的研究表明，PE的各种提取物和成分具有抗炎作用；因此，我们推测TLR2可能是介导LWPE治疗肝纤维化的抗炎作用的关键靶点。此外，LWPE对肝纤维化大鼠TLR2/NF-κB信号通路的影响也值得进一步验证。

抑制受损肝脏中HSCs的活化和增殖已被广泛认为是肝纤维化的合适治疗策略。PDGF是激活HSCs最有效的有丝分裂原，与PDGFα和ß受体结合，激活下游ERK/MAPK和Akt/PKB信号通路，刺激HSCs增殖。然而，只有PDGFß受体（PDGFBR）在活化的HSCs上特异性过度表达。通过siRNA降低PDGFBR的表达，可以有效地减少体外HSC的激活和增殖，并在动物模型中抑制肝纤维化。ITGAV，即αV整合素，是异二聚体细胞表面蛋白，在肝纤维化的进展中起着关键作用，因为它们激活潜伏的TGF-β，这是一种已知的促纤维化细胞因子。实验证据表明，HSCs中ITGAV亚单位的缺失可保护小鼠免受CCl₄诱导的肝纤维化。ACE是肾素-血管紧张素系统（RAS）的关键蛋白水解酶，将十肽血管紧张素I（Ang I）转化为活性八肽血管紧张肽II（Ang II）。Ang II可通过Ang II 1型（AT1）受体诱导HSCs收缩和增殖，并刺激静止的HSCs活化和分化为肌成纤维细胞。一些研究应用了ACE抑制方法，表明减少Ang II的形成可以显著改善大鼠胆管结扎或CCl₄诱导的肝纤维化。因此，根据蛋白质组分析和免疫印迹分析的结果，我们推测LWPE可能通过干扰PDGFBR、ITGAV和ACE的表达来抑制HSCs。

总之，这些关键的DEPs与肝纤维化的病理生理学密切相关，包括ECM沉积、炎症、HSCs活化和增殖，这表明LWPE通过多靶点和多途径调节肝纤维化。此外，许多先前的体内毒性评估研究报告称，通过血液学和组织病理学检查、行为观察和生化标志物分析，PE提取物没有明显毒性作用。因此，PE有望成为开发安全且无副作用的抗肝纤维化多靶点药物的潜在来源。

结论

在本研究中，我们确定LWPE是AEPE抗肝纤维化的主要有效成分，蛋白质组学和生物信息学分析表明，LWPE可以调节多个靶点，包括COL1A2、ITGAV、TLR2、ACE和PDGFRB等，ECM受体相互作用、局灶粘附和PI3K-Akt信号通路以及其他途径发挥抗纤维化作用。原文链接：  https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.989995/full

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